BAB IV
EKSTRAKSI DAN PENGUJIAN AKTIVITAS AMILASE
A. Pre Lab
1.
Mengapa enzim amilase bisa
didapatkan pada kecambah biji-bijian?
|
Karena pada kecambah biji bijian mengandung banyak protein. Selama proses
perkecambahan biji melakukan aktivitas metabolism. Metabolisme biji berkaitan
dengan kegiatan enzim. Enzim amilase yang
ada diplasma sel diperlukan biji pada proses metabolisme senyawa pati yang
berfungsi mengkatalisa pemecahan (hidrolisis) senyawa pati menjadi uala
sederhana yang larut dalam air yang diperlukan untuk perkecambahan dan
pertumbuhan biji. Beta amylase yang ada pada kecambah biji – bijian tersebut
mengubah pati menjadi maltose melalui proses hidrolisis (Sari,2004)
|
2.
Jelaskan prinsip pengukuran
aktivitas enzim amilase secara kuantitatif pada percobaan ini?
|
Prinsip pengukuran kuantitatif ialah didasarkan pada perhitungan gula
pereduksi dari hasil hidrolisis pati dengan mengukur laju reaksi. Aktivitas
amilase dari enzim kasar ditentukan dengan cara mengukur jumlah gula
pereduksi yang dihasilkan oleh aktivitas hidrolisis pati. Satu unit aktivitas amilase adalah
banyaknya enzim yang dapat menghasilkan 1 µg glukosa permenit per ml larutan
enzim pada kondisi pengujian yang dilakukan (Naiola,2008). Tujuannya ialah
untuk mengetahui aktivitas enzim amilase pada varietas kacang hijau dari
sampel yang mengalami perlakuan yang berbedadengan penggunaan substart pati.
Kemudian aktivitas enzim amilase dapat diketahui melalui persamaan matematik standar maltosa dengan regresi
linier dan dihasilkan grafik standar.
|
3.
Bagaimana cara
mengidentifikasi secara kualitatif bahwa telah terjadi reaksi enzimatis pada
percobaan ini?
|
Cara
mengidentifikasinya ialah telah terjadi perkecambahan pada sampel ialah
mengalami perubahan warna dan dihasilkan endapan. Biasanya parameter yang
diamati antara lain air dan kadar protein tunas; pH; dan aktivitas
alfa-amilase (Anna,2007)
|
B. Diagram
Alir
Ekstraksi enzim amilase
·
persiapan sampel
|
Bahan
|
|
Hasil
|
·
Ekstraksi enzim amilase
|
Bahan
|
|
50 ml buffer asetat (0,1 – 0,5 M)
pH 5,5
|
|
Hasil
|
Pengujian Aktivitas Enzim Amilase
·
Persiapan substrat pati
|
Bahan
|
|
1 g soluble starch (Merck)
|
Larutan diaduk dan dipanaskan hingga
|
Hasil
|
·
Pengukuran aktivitas enzim hasil ekstraksi
|
Bahan
|
|
1 ml larutan substrat pati
|
|
2 ml DNS (3,5 dinitro salisic acid)
|
|
20 ml akuades
|
didinginkan cepat pada air mengalir
Serapan diukur dengan spektrofotometer
Kadar maltosa dihitung dari plotting
|
50 mg maltosa
|
|
50 ml buffer HCl
|
Diencerkan hingga diperoleh
Dilakukan seri pengenceran dihasilkan
larutan standar maltosa 0 ppm, 100 ppm, 200 ppm,
|
3 ml DNS
|
Larutan didinginkan & diukur absorbansinya
|
Hasil
|
C. Hasil dan
Pembahasan
1.1
Kurva standar dan kurva
sampel
|
Konsentrasi (ppm)
|
Absorbansi
|
|
0 ppm
|
0,09
|
|
100 ppm
|
0,115
|
|
200 ppm
|
0,218
|
|
300 ppm
|
0,322
|
|
400 ppm
|
0,4
|
|
500 ppm
|
0,435
|
|
600 ppm
|
0,577
|
Kurva standar
Persamaan regresi linier standar Y = 0,081x – 0,018
·
Kacang hijau kering
Y = 0,081x – 0,018
0 = 0,081x – 0,018
0,081x = 0,018
x = 0,018/0,081
x = 0,22 M
·
Kacang hijau direndam 12
jam
Y = 0,081x – 0,018
0,089 = 0,081x – 0,018
0,081x = 0,018 + 0,089
0,081x = 0,107
x = 0,107/0,081
x = 1, 3209 M
·
Kacang hijau dikecambahkan
12 jam
Y = 0,081x – 0,018
0,106 = 0,081x – 0,018
0,081x = 0,106 + 0,018
0,081x = 0,124
x = 0,124/0,081
x = 1,5308 M
·
Kacang hijau dikecambahkan
24 jam
Y = 0,081x – 0,018
0,157 = 0,081x – 0,018
0,081x = 0,018 + 0,157
0,081x = 0,175
x = 0,175/0,081
x = 2,1605 M
·
Kacang hijau dikecambahkan
48 jam
Y = 0,081x – 0,018
0,144 = 0,081x – 0,018
0,081x = 0,018 + 0,144
0,081x = 0,162
x = 0,162/0,081
x = 2 M
|
Konsentrasi
|
Absorbansi
|
|
0,22
|
0,00
|
|
1,3209
|
0,089
|
|
1,5306
|
0,106
|
|
2,1605
|
0,157
|
|
2
|
0,144
|
Kurva sampel
Persamaan regresi linier sampel Y = 0,090x – 0,017
1.2
Perhitungan
|
Aktivitas enzim alfa-amilase = Cx 1/T x 1
unit/1 mikromol
|
Keterangan :
C = konsentrasi maltosa per ml ekstrak enzim (mikromol)
T = waktu inkubasi (menit)
1 unit enzim alfa-amilase = besarnya aktivitas enzim yang dibutuhkan untuk
membebaskan 1 mikromol maltosa per menit per ml enzim
·
Kacang hijau kering
Aktivitas enzim = 0,22 x 1/3 x 1 unit/1 mikromol
= 0,0733 mikromol
·
Kacang hijau direndam 12
jam
Aktivitas enzim = 1,3209 x 1/3 x 1 unit/1 mikromol
= 0,4403 mikromol
·
Kacang hijau dikecambahkan
12 jam
Aktivitas enzim = 1,5306 x 1/3 x 1 unit/1 mikromol
= 0,5102 mikromol
·
Kacang hijau dikecambahkan
24 jam
Aktivitas enzim = 2,1605 x 1/3 x 1 unit/1 mikromol
= 0,72016 mikromol
·
Kacang hijau dikecambahkan
48 jam
Aktivitas enzim = 2 x 1/3 x 1 unit/1 mikromol
= 0,6666 mikromol
1. 2 Tuliskan hasil pengamatan dari percobaan!
|
Sampel
|
Aktivitas
Enzim
|
|
Biji
kering
|
0,0733
mikromol
|
|
Biji
direndam
|
0,4403
mikromol
|
|
Kecambah
umur 12 jam
|
0,5102
mikromol
|
|
Kecambah
umur 24 jam
|
0,7201
mikromol
|
|
Kecambah
umur 36 jam
|
0,6667
mikromol
|
2.
Analisa prosedur
Langkah yang pertama yaitu
menyiapkan alat – alat dan bahan yang akan digunakan untuk praktikum yaitu
untuk persiapan sampel dibutuhkan mortar, kertas saring,
sentrifuse, karet hisap, pipet volume 1 ml, beaker glass 250 ml, tabung reaksi
dan rak, waterbath, spektrofotometer, kuvet dan bahannya yaitu biji kacang
hijau kering, buffer setat (0,1 – 0,5 M) pH 5,5, kertas saring. Sedangkan untuk
ekstraksi dibutuhkan pipet volume, waterbath, spektrofotometer dan bahan reagen
DNS. Yang pertama ialah persiapan sampel. Sampel terdiri dari lima macam yaitu
kacang hijau kering, kacang hijau direncam
12 jam, kacang hijau dikecambahkan 12 jam, kacang hijau dikecambahkan 24 jam,
dan kacang hijau dikecambahkan 48 jam.
Masing – masing sampel dihaluskan menggunakan mortar sampai halus. Kacang
hijau dihaluskan terlebih dahulu karena enzim amilase berada didalam plasma sel
sehingga disebut dengan endoamilase. Setelah itu sampel ditimbang sebanyak 5
gram kemudian ditambahkan 50 ml buffer asetat pH 5,5 yang fungsinya untuk
mempertahankan pH sampel, dibiarkan selama 30 menit. Lalu disaring dengan
kertas Whatman dilanjutkan dengan sentrifugasi 1500 rpm selama 30 menit,
setelah itu supernatannya diambil untuk uji aktivitas. Dalam ekstraksi enzim
amilase dibutuhkan substrat pati sebagai substratnya. Substrat pati yang
digunakan 1%. Ekstrak enzim yang sudah dibuat tadi fungsinya sebagai katalis
yang akan mempercepat laju hidrolisis pati. 1 ml enzim hasil ekstraksi tersebut
ditambahkan dengan 1 ml larutan substrat pati 1% kemudian diinkubasi 3 menit
pada suhu optimum 30o.
Langkah selanjutnya ditambah dengan 2 ml DNS (3,5 dinitro salicilic acid)
kemudian dipanaskan sampai mendidih, lalu didinginkan cepat pada air mengalir
dan ditambah 20 ml akuades. Ketika ditambahkan DNS warnanya kuning kecokelatan
namun setelah dipanaskan berubah menjadi merah bata. Reagen DNS mendeteksi
adanya gula reduksi dalam sampel berupa disakarida dalam bentuk maltosa dari
hasil hidrolisis substrat pati oleh enzim amilase. Serapan diukur dengan
spektrofotometer pada panjang gelombang 550 nm. Kemudian dilakukan perhitungan
kadar maltosa yang kali ini dilakukan oleh asisten praktikum.
Setelah melakukan praktikum, selanjutnya ialah perhitungan. Diawali dengan
pembuatan kurva standar telah diberi data berupa konsentrasi ppm dan
absorbansi, kemudian dihasilkan persamaan. Absorbansi yang dihasilkan sampel
menggunakan spektrofotometer merupakan sumbu y, sedangkan x yang dicari
merupakan konsentrasi dari setiap sampel. Kemudian dibuat kurva dan didapatkan
persamaan. Selanjutnya perhitungan aktivitas enzim dengan rumus diatas sehingga
didapatkan nilai aktivitas enzim.
3.
Perbandingan sampel dengan
literatur
Dilihat dari perhitungan aktivitas enzim diatas, dihasilkan bahwa aktivitas
enzim dari kacang hijau kering sebesar 0,0733
mikromol; kacang hijau direndam 12 jam aktivitas enzimnya sebesar 0,4403
mikromol; kacang hijau dikecambahkan 12 jam sebesar 0,5102 mikromol; kacang
hijau dikecambahkan 24 jam sebesar 0,7201 mikromol; dan kacang hijau
dikecambahkan 48 jam sebesar 0,6667 mikromol. Menurut (Suarni,2007) semakin
lama biji kacang hijau dikecambahkan, maka aktivitas enzim amilase nya akan
semakin bartambah hal ini disebabkan karena enzim menghidrolisis sari – sari
makanan (pati) dalam biji sehingga kecambah yang umurnya lebih lama melibatkan
enzim dalam menghidrolisis juga semakin banyak. Sedangkan untuk biji kering
aktivitas enzimnya sangat kecil karena pada biji kering belum ada aktivitas
metabolisme. Jika dikaitkan dengan hasil praktikum diatas, bahwa memang tepat,
pada biji kering aktivitasnya sangat kecil, dan untuk kacang hijau yang
direndam dan dikecambahkan aktivitasnya semakin bertambah seiring bertambahnya
usia kecambah.
Jika diurutkan dari paling besar sampai paling kecil
ialah sebagai berikut kecambah 24 jam; kecambah 48 jam; kecambah 12 jam;
direndam 12 jam; dan biji kering. Terdapat sedikit perbedaan dengan literatur,
yaitu kecambah 24 jam lebih tinggi aktivitasnya daripada kecambah 48 jam. Hal
itu dapat terjadi karena mungkin saat penghancuran biji kacang hijau enzim
dalam biji kecambah 24 jam lebih banyak dari biji kecambah 48 jam sehingga saat
diberi akuades enzimnya aktif atau karena pengaruh keberadaan kofaktor atau
koenzim yang dibantu kerja enzim.
Aktivitas enzim juga menunjukkan banyaknya maltosa yang
dapat dibebaskan akibat reaksi substrat pati dengan enzim milase. Jadi semakin
tinggi aktivitas enzim dari biji tersebut maka maltosa yang dihasilkan juga
semakin banyak. Sehingga maltosa dalam biji yang sudah dikecambahkan lebih
banyak daripada biji dalam keadaan kering (Ramansyah,2004)
4.
Faktor – faktor yang
memengaruhi aktivitas enzim amilase.
Faktor – faktor yang memengaruhi aktivitas enzim amilase antara lain
1.
Suhu. Suhu yang terlalu tinggi
akan mendenaturasi enzim sehingga bagian aktif enzim terganggu dan menurunkan
konsentrasi serta aktivitas enzim.
2.
pH. pH efektif umumnya 4,5 –
8. pH yang terlalu tinggi atau terlalu rendah akan membuat enzim nonaktif secara
irreversible karena denaturasi protein.
3.
Konsentrasi enzim. Konsentrasi
enzim pada subsrat tertentu, kecepatan reaksi bertambah dengan bertambahnya
konsentrasi enzim.
4.
Konsentrasi substrat. Umumnya
konsentrasi substrat akan menaikkan kecepatan reaksi akan tetapi pada batas
tertentu tidak terjai peningkatan kecepatan reaksi walaupun konsentrasi
substrat diperbesar.
5.
Adanya zat inhibitor. Adanya
zat inhibitor akan menghalangi sisi aktif enzim bergabung dengan substrat yang
spesifik sehingga reaksi antara substrat enzim terganggu.
5.
Kesimpulan
Prinsip menguji aktivitas enzim amilase dari kecambah biji – bijian dimana
aktivitas enzim amilase ditunjukkan dan diukur dari banyaknya maltosa yang terbentuk
setelah substrat pati diinkubasi dengan enzim amilase. Aktivitas enzim
dipengaruhi oleh beberapa faktor yaitu suhu, pH, konsentrasi enzim, konsentrasi
substrat, dan zat inhibitor. Semakin lama usia kecambah maka atkivitas enzim
semakin tinggi dan sebaliknya. Dari hasil praktikum dapat disimpulkan aktivitas
enzimnya dari paling besar sampai
paling kecil ialah sebagai berikut kecambah 24 jam; kecambah 48 jam; kecambah
12 jam; direndam 12 jam; dan biji kering dengan hasil kacang hijau kering sebesar 0,0733
mikromol; kacang hijau direndam 12 jam aktivitas enzimnya sebesar 0,4403
mikromol; kacang hijau dikecambahkan 12 jam sebesar 0,5102 mikromol; kacang
hijau dikecambahkan 24 jam sebesar 0,7201 mikromol; dan kacang hijau
dikecambahkan 48 jam sebesar 0,6667 mikromol.
DAFTAR PUSTAKA
Anna Poedjiadi, 2007.Dasar – Dasar Biokimia.Jakarta:UI-Press
Naiola, Elidar.2008.Mikrobia Amolitik pada Nira dan Laru dari Pulau Timor, Nusa Tenggara
Timur.Jurnal BiodiversitasVol 9. No 3, Hal 165-168
Ramansyah,
Maman dan I Made Sudiana. 2004. Optimasi Analisis Amilase Dan Glukanase Yang
Diekstrak Dari Miselium Pleurotus
ostreatusDengan Asam 3,5 Dinitrosalisilat. Berk. Penel. Hayati: 9 (7-12). 2003
Sari, Lucia dwi
Amartina.2004. Hubungan Aktivitas Enzim Amilase Dengan Perkecambahan Tiga Varietas Kedelai ( Glycine Max (L)
Marill) yang Berbeda. Undergraduate
thesis, FMIPA Undip.
Suarni dan Rauf
Patong.2007. Potensi Kecambah Kacang Hijau sebagai Sumber Enzim Α-Amilase. Indo. J.
Chem., 2007, 7 (3), 332-336
No comments:
Post a Comment